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感受态专题:电转化流程的介绍

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若相惜 发表于 7 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式

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感受态专题:电转化流程的介绍
感受态专题:电转化流程的介绍
点击次数:1002 发布日期:2013-11-6 
来源:上海北诺生物科技有限公司


一、电转化感受态细胞的制备
1.用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)
2.37℃,220rpm,培养14-16个小时。
3.第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.3-0.4时,停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟。
5.弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4℃,4000rpm离心10分钟。
6.弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min。
7.弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
8.弃上清,每个离心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀悬浮后,将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中,-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率。
9. 次日观察转化子生长情况,并记录。
二、连接产物纯化
1.将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中,加入下列试剂:
10μl of ddH2O
2μl of 3M NaAC(PH5.2)
50μl of 无水乙醇
轻轻混匀,稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上;
2.4℃,top Speed 离心30分钟;
3.小心移去上清,避免接触到管底的沉淀物;
4.加入500μl70%的乙醇,轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注:不要离心混匀);
5.4℃,top Speed离心5分钟;
6.小心移去上清,将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味;
7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀,4℃短期保存,-20℃长期保存备用;
三、电转化
1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;
2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中,将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
3.将40~100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中,小心混匀,冰上放置10min。
4.打开电转仪,调至Manual,调节电压为2.1KV。
5.将此混合物转移至已预冷的电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部;
6.将电极杯推入电转化仪,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中。
7.37℃,220-250rpm复苏1小时。
8. 取20μl转化产物加160μlSOC涂板,放于37℃温室,过夜培养,次日查看转化结果。其余菌液加1:1的30%的甘油后混匀-80℃保存。
注:每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ,SOC 80μl,IPTG 20 μl。
四、电击杯清洗流程
1.用清水将电击杯稍冲一下。
2.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3.弃去酒精,再用蒸馏水冲洗2~3遍,然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4.加入无水乙醇2ml于电击杯中,浸泡30分钟。
5.弃去无水乙醇,于通风厨内挥干乙醇。
6.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用。
注:1.不同样品使用的电机杯应分开;
2.每周用1%酒精浸泡30分钟。



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