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原代细胞培养的几种常见技术

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若相惜 发表于 4 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式

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原代细胞培养的几种常见技术
原代细胞培养的几种常见技术
点击次数:1278 发布日期:3-16 


原代细胞传代技术
一、贴壁细胞的消化法传代1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。2、加入1ml左右消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使瓶底细胞都浸入溶液中。3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察,发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时,弃去消化液,加入培养液终止消化。4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分别接种到另外两到三个培养瓶中,置37℃培养箱中继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
二、悬浮细胞的传代1、直接传代 ① 让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后,将上清吸掉1/2-2/3。② 用吸管吹打形成细胞悬液后,分别接种到另外两到三个培养瓶中,置37℃培养箱中培养。2、离心法传代① 将细胞连同培养液一并转移到离心管内,离心800-1000rpm,5分钟。② 去除上清,加新的培养液到离心管内,用吸管吹打使之形成细胞悬液。③ 将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中,置37℃培养箱中培养。
原代细胞冻存技术
1、选用生长情况好,数量较多的原代细胞,冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用0.25%胰酶常规消化将细胞消化下来,将细胞悬液收集至离心管中。3、1000rpm离心5分钟,弃上清液。4、沉淀加含DMSO的培养液,计数,调整至(1-10)×106/ml。
5、将悬液分至冻存管中,每管1ml。
6、密封冻存管,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。7、用记号笔标明细胞种类,冻存日期。
8、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(—80℃过夜)→液氮。
原代细胞复苏技术
1、取出细胞,迅速放入37℃温水中快速解冻。2、吸出细胞悬液,并加10倍以上培养液。3、1000r/分钟离心5分钟,去除上清。4、用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入37℃ CO2培养箱静置培养。镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液,继续培养。
原代细胞染色技术
一.台盼蓝染色1、制备单个细胞悬液,并作适当稀释(106细胞/ml)。2、染色:取9滴细胞悬液移入小试管中,加一滴0.4%台盼蓝溶液,混匀。3、计数:在3分钟内,用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。4、镜下观察,死细胞被染成蓝色,而活细胞拒染。5、按公式计算细胞活力。 二.伊红Y染色1、制备1×106-5×106细胞/ml的细胞悬液。2、取0.1ml细胞悬液加0.1ml伊红Y染液混合。3、用计数板镜下计数活、死细胞数。4、镜下观察,着红色的为死细胞。按公式计算细胞活力。三.苯胺黑染色实验1、制备1×106-5×106细胞/ml的细胞悬液。2、将1份1%苯胺黑溶液与含血清生理盐水作1:9混合稀释,使其成0.1%苯胺黑染液。3、取0.1ml细胞悬液加0.1ml苯胺黑染液混合。室温放置10分钟。4、用计数板镜下计数 ,黑色细胞为死细胞,按公式计算活细胞率。原代细胞计数技术
1、准备计数板:用酒精清洁计数板及专用盖玻片,然后轻轻拭干。2、制备细胞悬液:用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞,制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/ml,若细胞数很少,应将悬液离心(1000rpm,2分钟),重悬浮于少量培养液中。3、加样:用习惯轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。4、计数:计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000。



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